Este estudo teve como objetivo desenvolver levedura híbrida não OGM resistente ao congelamento para massa de pão francês congelada. Os híbridos foram gerados por cruzamento direto, utilizando cepas de Saccharomyces cerevisiae provenientes da indústria de etanol (PE-2) e levedura de panificação (FLE). Quatro híbridos viáveis foram gerados e denominados F5P1, F5P33, F5P40 e F5P42. De acordo com as análises das microplacas de 96 poços, as curvas de crescimento dos híbridos após congelamento e posterior descongelamento apresentaram comportamento semelhante àqueles sem congelamento. Em teste de desempenho após a etapa de congelamento, F5P1 e F5P40 obtiveram maior índice de desenvolvimento, com valores de (147,1 ± 2,5)% e (102,1 ± 5,6)%, respectivamente. O pico alcançado pelo F5P1, após 50 min, foi semelhante ( p > 0,05) ao do FLE, que foi aos 110 min. A diferença entre o tempo necessário para F5P1 atingir o pico de crescimento com e sem congelamento foi de 10 min, enquanto para FLE essa diferença foi três vezes maior, o que destaca a melhoria da resistência ao congelamento do híbrido. Portanto, o híbrido F5P1 apresentou capacidade de fermentação semelhante ao FLE ( p > 0,05) e melhor resistência ao congelamento, o que indica seu potencial para aplicação em massa de pão francês congelada.